Сайт для врачей о
клинической лабораторной диагностике

Гликоген локализуется в цитоплазме клеток и играет важную роль в энергетическом метаболизме клеток. При цитохимическом исследовании гликогена используют главным образом PAS-реакцию или ШИК-реакцию (по названию реактивов - шифф-йодная кислота).

Метод Шабадаша

Под влиянием перйодата калия гликоген окисляется с образованием альдегидных соединений, легко реагирующих с реактивом Шиффа (фуксин-сернистая кислота). В местах локализации гликогена выявляется вишнево-фиолетовое окрашивание, по интенсивности которого можно судить о количестве гликогена в клетках.

Посуда и оборудование

• Химические стаканы емкостью 50 мл или кюветы.
• Мерные цилиндры.
• Градуированные пипетки.
• Колбы емкостью 250 мл.
• Воронки.
• Горелки.
• Термостат.
• Весы.

Реактивы

• 0,03 М раствор перйодата калия или натрия: 230 мг перйодата растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Готовят перед употреблением.
• Реактив Шиффа: 1 г основного фуксина растворяют в 200 мл кипящей дистиллированной воды. По мере охлаждения в раствор добавляют 1 г метабисульфита калия и 20 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Оставляют на сутки. Для полного обесцвечивания добавляют растолченную таблетку карболена, оставляют на сутки, затем фильтруют. Реактив сохраняют в темноте (лучше на холоде) в плотно закрытой посуде. Годен к употреблению в течение нескольких месяцев (легкая степень покраснения свидетельствует о непригодности реактива).
• Сернистая вода: к 10 мл 10 % раствора метабисульфита калия добавляют 200 мл дистиллированной воды и 10 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Готовят перед употреблением.
• Реактив Шабадаша: к 100 мл этилового спирта добавляют 1,8 г нитрата меди, 0,9 г нитрата кальция и 10 мл формалина.
• 1 н. раствор соляной кислоты (82,5 мл концентрированной соляной кислоты удельного веса 1,19 доливают дистиллированной водой до 1 л).
• 0,1 % спиртовой раствор светло-зеленой краски (лихтгрюн).

Ход окраски

• Препараты фиксируют (тотчас после приготовления) в жидкости Шабадаша в течение 30 мин.
• Промывают в двух сменах дистиллированной воды.
• Погружают в раствор перйодата на 20 мин (в темноте).
• Промывают в трех сменах дистиллированной воды.
• Ополаскивают в сернистой воде (в течение 1 - 2 мин).
• Окрашивают реактивом Шиффа в течение 30 - 40 мин (в темноте).
• Промывают в трех сменах сернистой воды по 3 мин.
• Промывают в трех сменах дистиллированной воды по 3 мин.
• Окрашивают светло-зеленой краской в течение 10-20 с.
• Промывают в дистиллированной воде.

Для проведения реакции удобно все растворы поместить в химические стаканчики или кюветы и переносить препараты в указанной выше последовательности.

В настоящее время существуют реагенты для цитохимического исследования на гликоген заводского производства, которые более просты в применении. К сожалению, не все из них обладают хорошим качеством.

Результат метода Шабадаша

Гликоген окрашивается в вишнево-фиолетовый цвет на зеленом фоне препарата.

Расчет количества гликогена производят по полуколичественному методу или выражают в процентах.

Кроме гликогена, положительную реакцию могут давать такие ШИК-положительные вещества, как кислые и нейтральные мукополисахариды, мукопротеины, гликопротеины и др. Гликоген легко дифференцировать от других веществ пробой со слюной или диастазой.

Проба со слюной.

Препарат помещают в свежесобранную слюну и оставляют на 30 мин в термостате. Затем производят окраску на гликоген приведенным выше методом. Инкубация препаратов со слюной способствует расщеплению гликогена, и при реакции с реактивом Шиффа не получается розовой окраски.

Идентифицировать гликоген можно также путем предварительной инкубации мазков с амилазой (1 мл профильтрованной амилазы растворить в 40 мл физиологического раствора) в течение 30 мин в термостате.

На практике проба со слюной обычно не проводится, поэтому под PAS-положительным материалом понимаются, как правило, все полисахариды, а не только гликоген.

Нормальные величины метода Шабадаша

В мазках периферической крови гликоген содержится в цитоплазме нейтрофилов (в виде обильной мелкой зернистости), цитоплазме лимфоцитов (в виде небольшого количества крупных зерен) и тромбоцитах (в виде одиночных крупных зерен). В пунктате костного мозга гликоген выявляется в нейтрофилах разной степени зрелости, лимфоцитах и мегакариоцитах.

Концентрация PAS-положительного материала в клетках гранулоцитопоэза нарастает по мере созревания клеток. Диффузное окрашивание цитоплазмы обычно свойственно наиболее молодым клеткам гранулоцитарного ряда (миелобласты, промиелоциты, миелоциты). В зрелых нейтрофилах содержится много PAS-положительного вещества в виде мелких гранул, упакованных так плотно, что цитоплазматический фон плохо различим. У здоровых людей количество интенсивно окрашенных нейтрофилов крови (+++) колеблется в пределах 2—12 %, средней интенсивности окраски (++) - в пределах 72—90%, слабо окрашенных (+) — от 4 до 18%. СЦК равен 1,71—2,04. Некоторые авторы приводят более высокие значения СЦК гликогена в нейтрофилах здоровых людей (2,485 - 2,555). У лиц пожилого и старческого возраста отмечено достоверное снижение СЦК гликогена (1,93 - 2,03).

В зрелых эозинофилах и базофилах PAS-положительный материал располагается следующим образом: специфические гранулы остаются неокрашенными и резко выделяются на фоне диффузного окрашивания цитоплазмы.

В моноцитах гликоген чаще выявляется в виде мелкой пылевидной зернистости на фоне светло-розового диффузного окрашивания.

В лимфоцитах крови здоровых людей гликоген содержится в виде небольшого числа гранул в 8,1 - 12,7% клеток. Некоторые авторы дают цифры от 2 до 30%.

В норме от 3 до 10% клеток эритроидного ряда содержат мукополисахариды.

В мегакариоцитах костного мозга гликоген обнаруживается в виде гранул (от единичных до 30—50), напоминая скопления кровяных пластинок. У здоровых людей число гликогенположительных мегакариоцитов составляет 58,45 - 65,55 %. В тромбоцитах PAS-положительный материал выявляется в виде мелких рассеянных гранул по периферии клетки либо в виде интенсивного центрально расположенного пятна.

Клиническое значение метода Шабадаша

Увеличение содержания гликогена в нейтрофилах наблюдается при различных воспалительных процессах, эритремии, сахарном диабете, уменьшение - при агранулоцитозах, лучевой болезни, хроническом миелолейкозе, особенно при прогрессировании процесса.

Повышение числа гликогенположительных лимфоцитов (до 70 - 80 %) характерно для лимфопролиферативных заболеваний, особенно хронического лимфолейкоза.

При хроническом миелолейкозе содержание гликогена в гранулоцитах уменьшается приблизительно в 2 раза по отношению к норме, хотя общее его количество, определяемое биохимическими методами, может быть даже повышенным вследствие лейкоцитоза.

При тромбоцитопенической пурпуре и симптоматических тромбоцитопениях число гликогенположительных форм мегакариоцитов значительно снижено, после спленэктомии оно повышается до нормальных величин.

При острых лейкозах гликоген можно обнаружить в бластных клетках: при остром миелобластном лейкозе в виде мелкой зернистости в цитоплазме или в виде слабого диффузного ее окрашивания, причем в части бластов PAS-реакция отрицательная. При остром промиелоцитарном лейкозе наблюдается яркое диффузное окрашивание цитоплазмы. В монобластах реакция может быть отрицательной, слабо положительной в диффузной или диффузно-гранулярной форме (когда продукт реакции выявляется в виде рассеянных мелких или средних гранул, располагающихся по краю цитоплазмы, на диффузном фоне). При эритромиелозе гликоген в виде гранул обнаруживается в эритробластах, в виде диффузного окрашивания разной интенсивности - в нормобластах. Лимфобласты содержат гликоген в цитоплазме в виде средних и крупных гранул, располагающихся венчиком вокруг ядра, иногда сливающихся в блоки, на неокрашенном фоне. Количество клеток с таким характером PAS-реакции сильно варьирует при различных случаях острого лимфобластного лейкоза.

Цитохимическое исследование на гликоген можно проводить не только в мазках крови и костного мозга. Так, например, можно исследовать мазки влагалищного эпителия и по результатам исследования судить о функциональном состоянии яичников. В норме у женщин обнаруживают много гликогена в клетках, в то время как обеднение их гликогеном свидетельствует о нарушении функции яичников.

В опухолях количество гликогена различно: зрелые доброкачественные опухоли содержат много гликогена, в незрелых раковых опухолях количество гликогена резко уменьшено. Снижение гликогена в опухолевых клетках, вероятно, может быть использовано как показатель злокачественности опухоли.

Микрофотографии ШИК-реакции:

In normal bone marrow diffuse positive PAS reaction is visible in megakaryocyte and mature neutrophils (especially segmented neutrophils)
Typical diffuse positve PAS reaction in three mature neutrophils (two segmented and one band neutrophil)
Fine granular positive reaction in a monocyte. In three neutrophil leucocytes the reaction is weaker and diffuse
Coarse granular reaction in the lymphocyte indicated by the arrow. Besides, there are five other granulocytes showing weak positive diffuse reaction (in segmented neutrophil leucocyte – strong reaction)

Литература:

• Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е. А. Кост. Москва "Медицина" 1975 г.
• Справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В. В. Меньшикова Москва "Медицина" 1987 г.
• Л. В. Козловская, А. Ю. Николаев. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования. Москва, Медицина, 1985 г.
• В.Г. Палагнюк - Цитохимическая диагностика острых лейкозов
• Исследование системы крови в клинической практике. Под ред. Г. И. Козинца и В. А. Макарова. - М.: Триада-Х, 1997 г.